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毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台,其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关.但胞内代谢物种类多、物化性质差异大、浓度低、周转快,对其绝对浓度的精确检测一直难于实现.本研究将超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用分析方法与13C同位素标记技术相结合,探索解决该难题的方法.首先,优化了超高效液相色谱的操作条件,利用3种色谱柱实现了64种常见中间代谢物的分离;对三重四极杆质谱仪的检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化,找到了对各种物质具有专一性的检测离子对.然后,利用全标记13C标记底物培养细胞,收集 ...
氮素是反刍动物的必需营养元素之一,蛋白质代谢实质上是氮素代谢.准确研究反刍动物瘤胃微生物氮素代谢会更真实的反映动物对蛋白质的消化、吸收和利用,在提高蛋白质利用率的同时减少氮素排放对环境的污染,也有助于完善反刍动物整体蛋白质周转体系,同时对于动物饲养标准的修订、饲料原料营养参数的准确性和合理配制日粮具有重要意义.为此,文章综述了微生物氮索循环机制、微生物氮合成量的测定方法、氮素循环模型和影响微生物氮素循环的主要因素.
细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)是在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析,还可通过质谱图上一对轻-重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平,实现对蛋白质的精确定量。SILAC结合质谱技术在定量蛋白质组学中发挥了巨大的作用,其应用范围从细胞系扩展到亚细胞器、组织与动物整体水平,具体的应用策略也在不断完善发展。我们总结评述了SILAC技术在差异表达蛋白质组、蛋白质翻译后修饰、药物蛋白质组和蛋 ...
目的:探索桔梗对绿原酸在体内分布的影响。方法:将小鼠分为桔梗组和对照组,桔梗组用桔梗水煎剂灌胃,对照组生理盐水灌胃,连续7天。选取金银花中有效化学成分绿原酸进行氚标记,尾静脉注射3H-绿原酸,应用放射自显影技术及液闪仪定量研究,观察桔梗对绿原酸在体内分布的影响。结果:放射自显影实验结果显示:5min时,桔梗组与盐水组光密度值比较肺、脑、肠、心、肝的3H-绿原酸含量增加。12min时,桔梗组与盐水组光密度值比较肝、肾中3H-绿原酸含量增加。4h时,桔梗组与盐水组光密度值比较肝、肾中3H-绿原酸含量 ...
提出了1种判别标记肽假阳性的方法,根据同位素分布的概率原理计算出不同标记效率下的理论同位素分布,利用最小二乘法拟合得到标记肽的标记效率,根据标记肽的假阳性阈值来判断标记肽的假阳性,并使用本方法判断了比较蛋白质组试验中的3个标记肽,结果表明,在这3个标记肽中有2个阳性标记肽结果,1个假阳性标记肽,说明此方法简单可靠,可用于判定标记肽的假阳性,衡量标记肽和正常肽之间的相似性,判断质谱峰型的变化,排除标记肽假阳性对蛋白质定量的影响.
SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.
蛋白质定量研究已成为蛋白质组学的热点,它是疾病相关生物标志物发现的重要途径.基于稳定同位素标记的质谱分析技术是蛋白质定量最常用的方法之一.随着实验方法的发展和改进,定量数据处理方法也在不断更新与完善.一般来说,定量数据处理包括四步:搜库鉴定、图谱定量信息提取与计算、肽段丰度比计算和蛋白质丰度比计算及差异显著性分析,其中后三步是数据处理的核心.目前,后三步中每步都有多种可选算法,这些算法一般都是针对特定实验技术而提出的,缺乏深入的工作对它们进行系统比较和优化.为此,在总结目前主要实验技术方法的基础 ...
对各种含氮基质、葡萄糖和(或)根浸出液中培养的丛枝菌根真菌Glomus intraradices孢子, 在萌发过程中对不同氮素的利用及其氨基酸的生物合成进行了研究. 用稳定同位素标记及质谱仪来分析不同氮素的利用和氨基酸的生物合成. 以高效液相色谱测量氨基酸的浓度. 在缺少外源氮素的情况下, 丛枝菌根真菌孢子萌发时可以利用内部储存的含氮化合物生物合成游离氨基酸. 其中, 丝氨酸和甘氨酸是大量合成的氨基酸. 合成的氨基酸浓度在2周内随着萌发时间的增加而增加. 在有可利用的外源无机氮(铵盐、硝酸盐和尿 ...